前期准备主要是提取、反转录和引物设计部分。

1. RNA 提取注意事项

首先了解一下，RNA 抽提原则：保证 RNA 的一级结构、无其它物质的污染、得率高、覆盖所有转录本。再比较一下 Trizol 提取和试剂盒提取，Trizol 提取相对来说耗时长、含有害化学物质、纯度低、RNA 完整度不高；而试剂盒提取的优点是效率高、纯度高、完整度高，各位可根据实际科研情况选择操作方法。

RNA 提取注意事项：

① 使用无 RNase 的塑料制品和枪头，玻璃器皿要消毒，避免交叉污染；使用性能较好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；

② DEPC 有剧毒，小心配制；配制溶液应使用无 RNase 的水；

③ 操作人员应戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套；

④ 样品应避免反复冻融，否则影响提取 RNA 提取得率和质量；

⑤ 若下游实验对 DNA 非常敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 对 RNA 进行处理。

2. 反转录注意事项

秉承避免 RNA 被污染和降解的原则，按照产品说明书进行即可，本文对反转录过程的引物设计和注意事项给出了较明确的提示。

3. qPCR 引物设计注意事项

qPCR 过程中需要使用基因特异性引物扩增，从而分析目的基因表达量。

① 使用软件 Primer Premier 5.0；

② qPCR 过程中使用引物长度 25bp ，扩增产物长度 150bp ，可在 100bp-300bp 之间；

③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜过2℃，Tm 值在 60℃-65℃ 之间为佳；

④ 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC 含量控制在50%左右，3’端*一个碱基*为 G 或 C；

⑤ 引物内部或者正反两条引物间*避免出现有3个碱基以上的互补序列；

⑥ 引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补；

⑦ 引物设计完成后需进行扩增效率检测，将扩增效率相同的引物用于定量比较分析。