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人或动物体内(或胚胎)的组织,将其剪碎至1mm3的组织块,再采用如下实体组织材料的消化分离法进行原代细胞分离培养:
1、酶消化分离法(*冷消化法)
①细胞间质较少的软组织,如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等,用Hanks液清洗组织三次,剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃*。
④次日再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法(EDTA消化法)
①把组织块剪碎,呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
③加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清,加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应,并洗涤2-3次后,加入完全培养基。
⑤用吸管吹打,使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
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