昆明诺金科技有限公司生产销售山东绿都犬瘟热病一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书(20次) 云南昆明动物疫病PCR荧光定量检测试剂盒
犬瘟热病一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书(20次)
【注意】 用前请认真阅读注意事项。
【用途】 用于犬瘟热病的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
编号
数量
保存
SR-I
9mL
4℃
SR-II
14mL
TU-1
250uL
-20℃
TU-2
20uL
TU-3
TU-4
TU-5
450uL
TU-6
60uL
TU-7
25uL
TU-8
30uL
T
500 uL
【操作步骤】
1.RNA提取
(1) 取疑似犬瘟热病的病料(脑、肺脏、淋巴结、脾脏、分泌物等)1~4g于无菌研钵,研磨并用PBS液(pH7.2~7.4)稀释成1:4乳剂,分装1.5ml灭菌EP管,反复冻融2~3次,8000r/min离心5分钟。(病毒培养液,只需冻融1次即可8000r/min离心5分钟)
(2)取200uL上清液(或T),移入1.5mL灭菌EP管中,加入400uLSR-I,反复颠倒几次混匀,室温放置5~10分钟。
(3)加入180uL氯仿,漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。
(4)12000r/min离心10分钟,取上层水相(切忌,勿吸到两相之间的杂质),转移到一个新的EP管中,再加入等体积的异丙醇混匀,室温放置10分钟。
(5)12000r/min离心10分钟,弃去上清,加入SR-II 700uL,充分洗涤沉淀RNA后,12000r/min离心5分钟,小心吸去上清(注意:严格防止RNA丢失)。
(6)用洁净吸水纸吸干管壁的SR-II,室温放置2~3分钟。用20uLTU-5溶解,即为模板,即用或-70℃冻存备用。
2.One-Step RT- PCR加样体系
12.5uL
1uL
模 板
9.5uL
3.反应程序
4.电泳
称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入1.5uL的TU-8混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物5uL混合1uL TU-7,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加3uLTU-6,在120v 电压下,1×TAE液中电泳15分钟,在紫外成像仪下观察结果。
1 2
【结果判定】
在约340bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。
1.DL2000 Marker
2.标准阳性片段
【注意事项】
1.每次使用,开盖之前请先瞬时离心,使试剂沉于管底。
2.本试剂盒为20头份量诊断试剂,操作失误或移液器不准确造成终剂量不够情况,不予负责。
3.所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。
4.尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染,RNA抽提严格防止RNA酶污染,要求戴一次性塑料手套,并经常更换。
5.加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不、定时不准确造成无结果情况,不予负责。
6.吸头、离心管和PCR管在使用前,好用DEPC水(0.1%)处理,然后高压灭菌后烘干,操作过程尽量不要用手接触,可用镊子夹取。
7.注意防止试剂污染,在有效期限前用完。
8. TU-8所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。如若不甚接触,请立即用洗涤剂清洗。
【有效期】本制品有效期为1年,生产日期见包装侧面。
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昆明诺金科技有限公司生产销售山东绿都犬瘟热病一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书(20次) 云南昆明动物疫病PCR荧光定量检测试剂盒
犬瘟热病一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书(20次)
【注意】 用前请认真阅读注意事项。
【用途】 用于犬瘟热病的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
编号
数量
保存
SR-I
9mL
4℃
SR-II
14mL
4℃
TU-1
250uL
-20℃
TU-2
20uL
-20℃
TU-3
20uL
-20℃
TU-4
20uL
-20℃
TU-5
450uL
-20℃
TU-6
60uL
-20℃
TU-7
25uL
4℃
TU-8
30uL
4℃
T
500 uL
4℃
【操作步骤】
1.RNA提取
(1) 取疑似犬瘟热病的病料(脑、肺脏、淋巴结、脾脏、分泌物等)1~4g于无菌研钵,研磨并用PBS液(pH7.2~7.4)稀释成1:4乳剂,分装1.5ml灭菌EP管,反复冻融2~3次,8000r/min离心5分钟。(病毒培养液,只需冻融1次即可8000r/min离心5分钟)
(2)取200uL上清液(或T),移入1.5mL灭菌EP管中,加入400uLSR-I,反复颠倒几次混匀,室温放置5~10分钟。
(3)加入180uL氯仿,漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。
(4)12000r/min离心10分钟,取上层水相(切忌,勿吸到两相之间的杂质),转移到一个新的EP管中,再加入等体积的异丙醇混匀,室温放置10分钟。
(5)12000r/min离心10分钟,弃去上清,加入SR-II 700uL,充分洗涤沉淀RNA后,12000r/min离心5分钟,小心吸去上清(注意:严格防止RNA丢失)。
(6)用洁净吸水纸吸干管壁的SR-II,室温放置2~3分钟。用20uLTU-5溶解,即为模板,即用或-70℃冻存备用。
2.One-Step RT- PCR加样体系
TU-1
12.5uL
TU-2
1uL
TU-3
1uL
TU-4
1uL
模 板
9.5uL
3.反应程序
4.电泳
称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入1.5uL的TU-8混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物5uL混合1uL TU-7,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加3uLTU-6,在120v 电压下,1×TAE液中电泳15分钟,在紫外成像仪下观察结果。
1 2
【结果判定】
在约340bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。
1.DL2000 Marker
2.标准阳性片段
【注意事项】
1.每次使用,开盖之前请先瞬时离心,使试剂沉于管底。
2.本试剂盒为20头份量诊断试剂,操作失误或移液器不准确造成终剂量不够情况,不予负责。
3.所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。
4.尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染,RNA抽提严格防止RNA酶污染,要求戴一次性塑料手套,并经常更换。
5.加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不、定时不准确造成无结果情况,不予负责。
6.吸头、离心管和PCR管在使用前,好用DEPC水(0.1%)处理,然后高压灭菌后烘干,操作过程尽量不要用手接触,可用镊子夹取。
7.注意防止试剂污染,在有效期限前用完。
8. TU-8所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。如若不甚接触,请立即用洗涤剂清洗。
【有效期】本制品有效期为1年,生产日期见包装侧面。