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了解PCR反应中Taq酶的使用

来源: 上海邦景实业有限公司 >> 进入该公司展台 2022/05/16 15:47:58 已浏览:
导读:了解PCR反应中Taq酶的使用

PCR使用的Taq酶应该注意如下问题

为弥补taq酶这一缺点常将克隆后的序列进行测序,来确认所扩增序列的准确性。同时也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase,来确保扩增的准确性,Pfu DNAPolymerase有3 ’-5’的外切酶活性,5’-3’外切酶活性,是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率Z低的。但PCR产物为平端,不能进行Ta克隆!而解决此问题的办法是使用TaqPlus DNAPolymerase,该酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物,因此既能保证准确性又能保证能够进行Ta克隆。在使用中应该注意如下问题:


1.25ul体系中一般用量为0.1ul(用枪头沾一下即可),用量过多可能会出现非特异性扩增。


2.PCR体系构建过程中Z后加入的一种成分,因此只有在其他试剂加完之后才可从冰箱中取出加入。


3.Taq酶中含有甘油,故不结冰,若结冰则应丢弃。


4.对于预变性时间较长的PCR反应,应在预变性即将结束后加入酶,减少长时间高温对酶活力造成的损伤。


5.保存时间过长的酶可以适当增加用量。


PCR使用的taq酶在反应时由于丧失3’——>5’外切核酸酶活性,因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反应中,taq酶造成的错误的核苷酸错误的掺入率大概为每20000个核苷酸中就有一个,虽然表面上看起来不会有多大的影响,但是在分子克隆中如果有一个错误核苷酸掺入,很有可能造成移码突变,影响是严重的

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